UTILIZACIÓN DE APRENDIZAJE AUTOMÁTICO PARA ANALISIS PREDICTIVO EN MICROSCOPÍA FLIM DE MODELOS EXPERIMENTALES DE LESION..

UTILIZACIÓN DE APRENDIZAJE AUTOMÁTICO PARA ANALISIS PREDICTIVO EN
MICROSCOPÍA FLIM DE MODELOS EXPERIMENTALES DE LESION PULMONAR

INTRODUCCIÓN

La microscopía de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) ha demostrado un gran potencial para la caracterización de células y tejidos. Al utilizar la autofluorescencia tisular de moléculas como el NADH, es posible definir "huellas digitales" basadas en fluorescencia que facilitan el estudio de enfermedades como la lesión pulmonar aguda (ALI) y su impacto en la integridad, función y morfología del tejido. La ALI es una de las principales causas de insuficiencia respiratoria aguda en las UCI, afectando a alrededor de 3 millones de personas en todo el mundo cada año. El diagnóstico de ALI es desafiante, ya que depende de la interpretación histológica convencional, altamente subjetiva y condicionada por la experiencia del patólogo. Esto resalta la necesidad urgente de contar con herramientas objetivas, reproducibles y automatizables que complementen el análisis histológico tradicional.

En este proyecto se utilizaron ratones C57BL/6, incluyendo controles y ApoE knock-out (ApoE -/-), con lipopolisacárido (LPS) para evaluar la utilidad de FLIM en la caracterización del tejido pulmonar. El modelo ApoE -/- con dieta rica en grasas desarrolla condiciones como hipercolesterolemia y diabetes, lo que lo convierte en un modelo representativo de pacientes típicos de UCI.

Las muestras de tejido pulmonar de ocho grupos experimentales fueron analizadas mediante FLIM en un microscopio Leica Stellaris 8-STED, empleando diferentes longitudes de onda de excitación. Se entrenaron modelos de aprendizaje automático (ML) basados en ResNet para distinguir imágenes FLIM de tejido normal y patológico. Los diagramas de phasor aplicados a los datos FLIM permitieron que las redes neuronales aprendieran de la distribución y ubicación de los phasores. Este método posibilitó el entrenamiento a partir de imágenes 2D, lo que aceleró significativamente los tiempos de procesamiento gracias a la eficiencia de las técnicas basadas en transformada de Fourier.

La integración de FLIM y ML permite una discriminación más rápida y precisa entre tejido sano y enfermo, mostrando un gran potencial para futuras aplicaciones clínicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Modelo experimental: Se utilizaron ratones C57BL/6 (tipo silvestre B6 y ApoE -/-). Cada genotipo se dividió en dos subgrupos dietarios: dieta normal (ND) y dieta alta en grasas (HFD), resultando en cuatro grupos base: B6-ND, B6-HFD, ApoE -/- ND y ApoE -/- HFD. Todos los grupos fueron instilados intratraquealmente con $0,75\text{ \mu g/g}$ de lipopolisacárido (LPS) para inducir lesión pulmonar aguda (ALI), obteniéndose un total de 8 grupos experimentales ($n = 10$ por grupo).

2. Muestras histológicas: Se extrajeron los pulmones. Los tejidos fueron fijados en formol e incluidos en parafina. Se obtuvieron cortes seriados de $5\text{ \mu m}$ sin tinción.

3. Mediciones de microscopía FLIM: Las imágenes se adquirieron mediante microscopía FLIM resuelta en el tiempo en un microscopio Leica Stellaris 8-STED, con una longitud de onda de excitación de $440\text{ nm}$. Se analizaron los ocho grupos experimentales. Se tomaron diez imágenes por animal, obteniéndose un total de 800 puntos de dato.

4. Procesamiento de datos mediante aprendizaje automático: Los datos fueron preprocesados utilizando la biblioteca PhasorPy. Las imágenes se transformaron al espacio phasor. Las coordenadas phasor resultantes se representaron como histogramas de densidad 2D y se exportaron en formato PNG. Estas imágenes se emplearon para entrenar modelos de aprendizaje profundo en tres comparaciones binarias: B6 vs. APOE, Instilados vs. No instilados, y ND vs. HFD. En cada caso, el 80% de las imágenes se utilizó para entrenamiento ($n = 480$) y el 20% para validación ($n = 120$). Se evaluaron arquitecturas de redes neuronales convolucionales (CNN) preentrenadas (ResNet50, MobileNetV2).

RESULTADOS

(Paneles visuales y gráficos presentados):

• Histogramas de densidad en el espacio phasor para cada grupo y combinación de condiciones.

• Matrices de confusión obtenidas en el conjunto de validación ($n = 120$ imágenes):

  • Instilados vs. No instilados (B6 Instilado vs. B6 No Instilado / ApoE Instilado vs. ApoE No Instilado)

  • B6 vs. APOE

  • ND vs. HFD

• Tablas con métricas de desempeño de las redes:

  • Tabla de métricas de desempeño de la red MobileNetV2

  • Tabla de métricas de desempeño de la red ResNet18

CONCLUSIONES

• La mejor clasificación se obtuvo en Instilados vs. No instilados ($\text{exactitud} = 86\%$), seguida por B6 vs. APOE ($74\%$) y ND vs. HFD ($66\%$).

• Estos resultados destacan el potencial del análisis de phasor combinado con herramientas de aprendizaje automático para discriminar con precisión entre diferentes condiciones patológicas en datos de fluorescence lifetime imaging (FLIM).

• La integración de FLIM e inteligencia artificial permite una predicción y discriminación más rápidas entre tejido normal y patológico, con un fuerte potencial para su aplicación clínica.

Agradecimientos:

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