Microscopía multifotónica y por tiempo de vida (flim): herramientas avanzadas para el análisis cuantitativo de muestras biomédicas
Categoría: TRABAJOS CIENTÍFICOS
Área de conocimiento: Otros
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Introducción
La Unidad de Bioimagenología Avanzada (UBA), es una plataforma científica conjunta entre el Hospital de Clínicas (Udelar) y el Institut Pasteur de Montevideo. La UBA se enfoca en cuatro pilares fundamentales: servicios, diseminación/entrenamiento, investigación, y desarrollo tecnológico. Un aspecto esencial de su trabajo es el desarrollo de nuevo hardware, software y técnicas avanzadas de microscopía.
La UBA ha desarrollado dos instrumentos únicos en el país: la microscopía DIVER y la microscopía de dos fotones FLIM. La excitación por multi-fotón ofrece ventajas importantes sobre las técnicas convencionales, como la reducción del foto-daño y el aumento en la penetrabilidad en muestras con alta absorción o dispersión de luz, como tejidos biológicos. La excitación sucede a través de la absorción de dos fotones de la mitad de la energía en un volumen muy pequeño, dado que la luz es concentrada en pulsos y focalizada a través de la óptica del microscopio. Estos láseres pulsados presentan la posibilidad de ser utilizados para experimentos de tiempo de vida de fluorescencia. El tiempo de vida de una molécula fluorescente es un rasgo característico y nos permite interrogar qué le está sucediendo a esta molécula durante este escaso tiempo de vida (ns). Es por esto que la microscopía de tiempo de vida (FLIM) puede ser una herramienta poderosa para el diagnóstico de patologías. En particular se ha explotado para evaluar los cambios metabólicos celulares o en tejidos por la autofluorescencia proveniente del NADH. La fluorescencia del NADA ha resultado muy útil para definir "huellas dactilares" de la autofluorescencia en individuos normales o patológicos.
La microscopía DIVER permite la generación de segundo y tercer armónico (SHG/THG). El SHG ocurre cuando la luz de una longitud de onda λ interactúa con estructuras fibrilares no-centrosimétricas (como el colágeno I), generando una señal con la mitad de la longitud de onda incidente (λ/2). El THG se produce en cambios abruptos en el índice de refracción, como en las interfases polares/apolares (por ejemplo, gotas de grasa).
Los datos son procesados utilizando análisis de gráficos de fasores, el cual ha demostrado excelente performance para discriminar cambios metabólicos en modelos experimentales y muestras de pacientes.
Conclusiones
Las herramientas avanzadas de la UBA permiten un análisis cuantitativo de muestras biomédicas (células, tejidos, animales enteros in vivo e in vitro) sin necesidad de tinción y con el potencial de desarrollo de aplicaciones para el diagnóstico de patologías.
Se resalta la utilidad de contar con nuevas tecnologías avanzadas e instrumentos que emplean la multifotónica para el estudio en el campo biológico y biomédico.
Por último se destaca la necesidad del desarrollo continuo de nuevos métodos y herramientas tecnológicas para apoyar a la investigación biomédica y que las mismas sean accesibles al público.
Agradecimientos
(Logos: Chan Zuckerberg Initiative, Pasteur Network, ANII, CSIC, Latin America Bioimaging, PEDECIBA, Exposome Grant)
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