Desarrollo de un método de autocorrelación espacial en 2d para el análisis de muestras biomédicas

Introducción

Análisis tradicional

La identificación y cuantificación del daño pulmonar, tradicionalmente se realiza sobre cortes de hematoxilina y eosina, empleando diferentes herramientas de análisis, como el conteo de puntos o la segmentación de imágenes. Estos métodos demandan gran cantidad de tiempo y esfuerzo, siendo además dependientes del usuario, que implica que hay un sesgo relacionado con la persona que realiza la cuantización.

Figura 1 - Análisis histológico tradicional: Procesamiento de imágenes para cuantificar el grosor de tabique. Sistema de rejilla de puntos para técnica de conteo de puntos, sistema de puntos para obtención de volumen, corte en parafina de páncreas, tinción de metenamina de Jones. Sistema de intersecciones para obtención de densidad de superficie, corte en parafina de pulmón.

Incidencia de la patología

La valoración histológica del daño pulmonar a través de la histología es importante dado que el Síndrome de Distress Respiratorio Agudo (SDRA) y la Lesión Pulmonar Aguda (LPA) constituyen las causas más importantes de insuficiencia respiratoria severa, presentando una mortalidad de 30-60% de los casos y presentan un alto costo para los sistemas de salud.

Planteo

En este escenario, nos proponemos del desarrollo un método cuantitativo e independiente de sesgo a través del estudio de la heterogeneidad del tejido pulmonar a de la función de correlación espacial en imágenes. Tradicionalmente esta herramienta matemática es empleada en imágenes de fluorescencia para el estudio de difusión molecular así como en otras áreas como geología y ciencia de los materiales. Para el problema a tratar el método propuesto realiza el cálculo de la función de autocorrelación espacial en 2 dimensiones (2D-sACF) en imágenes RGB de hematoxilina-eosina (H&E) de tejido pulmonar. Proponemos validar la utilidad de esta herramienta en cortes histológicos de un modelo experimental de LPA en ratones C57BL/6 inducido por instilación traqueal de Lipopolisacárido bacteriano (LPS).

Materiales y Métodos

Función de Autocorrelación

La función de autocorrelación espacial G(x,y) en 2 dimensiones matemáticamente se obtiene multiplicando una matriz de números, en este caso, la imagen I(x,y), por su réplica trasladada una distancia (Δx,Δy): I(x+Δx,y+Δy) y sumando estos productos para todas las posibles distancias (Δx,Δy). Este cálculo evalúa la probabilidad de que pares de píxeles, separados por una distancia específica, tengan el mismo valor de intensidad. Analizando estos pares, podemos obtener información sobre la distribución y el comportamiento espacial de los rasgos en la imagen, tanto en las direcciones horizontal y vertical.

Figura 2 - Explicación de la ACF en 1 dimensión: (A) Señal f trasladada una distancia T, T/2 y T/4. (B) Autocorrelación de la señal f, observar que los puntos donde la ACF es máxima coincide con 0 y T, es mínima en T/4 y nula en T/2. (C) Imágenes procesadas de pulmón para grupo control vs daño y perfil de intensidades de una fila aleatoria. (D) Autocorrelación de las filas señaladas en (C) dónde se observa claramente la diferencia de la desviación entre ambos grupos. Para el caso control la señal decae mucho más rápido que el caso instilado.

Método computacional

El método computacional se implementó en Python 3.0 usando las librerías OpenCV, skimage, numpy, matplotlib y scipy. Los cortes histológicos se digitalizan y preprocesan (filtrado, segmentación, binarización) antes de calcular la función de autocorrelación. El algoritmo procesa un lote de imágenes, calcula la 2D-sACF mediante la transformada de Fourier bidimensional y ajusta la ACF por una elipse para obtener los semiejes que corresponden a las desviaciones estándar en x e y. El colapso será cuantificado a través del análisis estadístico con la 2D-sACF, de la cual se obtienen los parámetros σx y σy que permitirán comparar los grupos de estudio. Esta Información se calibra para obtener el grosor de los tabiques de manera cuantitativa e independiente del usuario. Los resultados de 2D-sACF se comparan con los obtenidos del análisis tradicional, aplicándose a imágenes RGB de H&E obtenidas por microscopía de campo claro, proveniente de grupos control y patológicos.

Figura 4 – Simulación
El algoritmo se valida a través de imágenes patrón simuladas, dónde se definen tres casos característicos, Alveolos Normal Diet (Control), Alveolos colapsados (Dañado) y Superalveolo (Colapsado con rotura del tejido). En cada caso se observa que el método identifica la condición del tejido a través del ajuste realizado por la elipsoide se obtienen los semiejes de la misma, que indican el ancho promedio del tejido contenido en la imagen, a medida que el daño pulmonar es más significativo, los semiejes aumentan.

Resultados

Análisis

Se procesaron 100 imágenes de 10 regiones en 10 animales del grupo control y 100 imágenes de 10 regiones en 10 animales del grupo patológico. Tras implementar el código para el procesamiento y cálculo de la 2D-sACF, se extrajeron los valores de los semi-ejes horizontal y vertical de la elipse, que indican las desviaciones en las direcciones x e y de la función de autocorrelación y se realizó un análisis estadístico de estas medidas.

(Imágenes: procesamiento de imagen original → filtrado/segmentación → mapa de autocorrelación con ajuste elíptico, para tres grupos: Control (SemiMajor axis= 16 pix), Instilado (SemiMajor axis= 38 pix) y High Fat Diet — HFD (SemiMajor axis= 79 pix))

Figura 4 – Procesamiento y ajuste: De arriba a abajo, imágenes de grupos Control, Instilado y High Fat Diet (HFD) con su ajuste por elipse al contorno de 0,6. Con este método se obtiene el ancho promedio de los tabiques en todo el tejido contenido en la imagen, mientras que con el análisis tradicional se obtiene solo el grosor de una sección de tejido elegida arbitrariamente por el usuario. Se observa que para los grupos patológicos los semi ejes de la elipse son claramente mayores con respecto al grupo control, lo que es coherente y indica que estos grupos presentan un daño pulmonar. Además de utilizar la información dada por los semiejes, también se puede observar que la orientación espacial de las elipses corresponden con la orientación preferida que siguen los rasgos en la imagen, en este caso los alveolos.

Figura 4 - Análisis estadístico: Gráficos de violín por gajos para 4 grupos Control, Instilado, HFD, HFD instilado. Se muestra la variación estadística entre grupos. Para el análisis estadístico se implementó el código para ejecutar un test de ANOVA con un post test de Tukey para muestras múltiples, y se muestran los resultados obtenidos a través de "gráficos de violín" (superplots) que reportan la distribución del conjunto de datos, considerándose valores significativamente diferentes cuando p < 0.05. En todos los casos se observa la tendencia del grupo sin lesión a valores promedios de σx y σy menores.

(Gráfico de violín mostrando distribución de datos para grupos: ctrl, inst, HFD, HFD inst)

Conclusiones

• Se comprueba la efectividad de la herramienta para identificar y caracterizar la lesión pulmonar en muestras histológicas, cuantificando de manera sencilla y autónoma el edema pulmonar.
• Se logró obtener un nuevo método que facilita y automatiza el análisis tradicional de la lesión pulmonar evitando errores sistemáticos dependientes del usuario que analiza.
• Se destaca el potencial de la herramienta para su aplicación en otro tipo de muestras histológicas utilizadas para diagnóstico, en las cuales se presenten una estructura y distribución patognomónica.
• Se está desarrollando el software de código libre y la interfaz gráfica amigable para hacer accesible el uso de la herramienta a usuarios sin experiencia en programación.

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