DESARROLLO PRECLÍNICO DE CÉLULAS ESTROMALES MESENQUIMALES DERIVADAS DE TEJIDO ADIPOSO DE DONANTES VIVOS Y FALLECIDOS

Introducción

El desarrollo de las Terapias Avanzadas y la Medicina Regenerativa implica desafíos en cuanto a la seguridad y potencia de los productos generados para aplicación clínica, lo cual hace imprescindible realizar estudios preclínicos para validar su producción. Las células estromales mesenquimales humanas (hMSC) han sido ampliamente investigadas con estos fines por tener ciertas propiedades de interés como la capacidad de diferenciación e inmunomodulación ver figura 1. Actualmente, se están evaluando en ensayos clínicos y se han aprobado algunos productos medicinales de terapias avanzadas (PMTA) basados en dichas células.

Fig. 1. Propiedades biológicas de las hMSC (esquema: MSC de MO, TA, etc. → Diferenciación (Osteoblastos, Condroblastos, Adipocitos) / Inmunomodulación (Proliferación, Citotoxicidad, Maduración, Producción de IgG) / Baja inmunogenicidad / Capacidad uso alogénico / Capacidad migración / Inflamación - Reparación tisular)

Las hMSC pueden aislarse de varios tejidos adultos siendo el tejido adiposo (TA) una de las fuentes preferidas por presentar mayor contenido de MSC y por obtener grandes cantidades del mismo. Por otro lado, el trasplante de tejidos y órganos de donantes fallecidos (DF) son procedimientos desarrollados, pero no así la utilización de células de DF para uso clínico. La obtención de hMSC derivadas de TA (hMSC-TA) en DF ha sido poco explorada.

Objetivo: El objetivo de este proyecto es desarrollar PMTAs basados en hMSC-TA de donantes vivos (DV) y DF a nivel preclínico.

Materiales y Métodos

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética del HC y autorizado por el INDT.

1. Colecta y procesamiento del TA
(Esquema: Colecta de TA por lipoaspiración (TA L) o por resección (TA R) → Baño antibióticos y lavado con PBS → Eliminación de vasos y tejido conectivo / Disgregación mecánica → Disgregación enzimática → Centrifugación para obtener fracción vascular → Filtrado con filtro 70 um → Recuento CN)

2. Análisis del material de partida y cultivo de hMSC-TA
(Esquema: Cultivo primario de CN → Ensayo CFU-F (recuentos CN/pozo) → Selección y expansión de MSC, con fórmulas de cálculo de número de duplicaciones y TDP)

3. Inmunofenotipo de hMSC-TA
(Esquema: proceso de citometría de flujo)

4. Diferenciación in vitro
(Esquema: Diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica, con tinciones Oil Red, Alizarin red y fijación/inclusión en parafina/coloración azul de Toluidina)

5. Cuantificación de factores de crecimiento en sobrenadantes (SN) de cultivo de hMSC-TA
(Esquema: cultivo de hADSC1-4 en medio 8 días alfa-MEM SFB 10% → análisis)

Resultados

1. Características de los donantes y del material de partida

A la fecha se procesaron 13 muestras de 10 donantes, con las características que muestran en la tabla.

Tabla — Características de los donantes (n=10) y de las muestras (n=13) procesadas:

(Abreviaturas: Índice de masa corporal (IMC), No determinado (ND), No aplica (NA), Tejido adiposo liposaspirado (TA L), tejido adiposo reseccionado (TA R), Desvío estándar (DE).)

2. Análisis del material de partida y cultivo de hMSC-TA

Se analizó el rendimiento del material de partida.

(Gráficos: CFU/g según medios (Mec.dig, Enz.+mec.dig) para TA L y TA R; % CFU-F por 10^6 para DV y DF)

Y el rendimiento de hMSC-TA en DV y DF.

(Gráficos: hADSC/g estimado según DV P1/DF P1/DV P2/DF P2; PD pasaje 1 y PDT pasaje 1; PD pasaje 2 y PDT pasaje 2, para DV PD/DF PD/DF PDT/DV PDT)

3. Inmunofenotipo de hMSC-TA

(Gráfico de barras: % células positivas para CD90, CD73, CD105, CD45/CD34/CD19/HLA-DR, comparando DV n=3 y DF n=2)

4. Diferenciación in vitro

(Imágenes de diferenciación Adipogénica, Osteogénica y Condrogénica, comparando DV I, DV sin I, DF I, DF sin I)

Se cultivaron las células en medio inductor de la diferenciación (I) y como control del ensayo se cultivan las hMSC-TA en medio no inductor (sin I). Se observa diferenciación en las hMSC-TA I. DV (n = 3) y DF(n=3).

5. Cuantificación de factores de crecimiento en sobrenadantes de cultivo de hMSC-TA

Tabla — Concentración (pg/ul) de Angio-2, EGF, EPO, FGF-basic, G-CSF, GM-CSF, HGF, M-CSF, PDGF-AA, PDGF-BB, SCF, TGF-a, VEGF:

Se observa un incremento de varios factores de crecimiento, como el Factor de crecimiento hepático (HGF) y el factor de crecimiento de células tronco (SCF), en el sobrenadante de las hMSC-TA de DV en relación al medio de cultivo con SFB al 10%.

Conclusiones

• Con las muestras procesadas a la fecha no se observan diferencias en el rendimiento celular, parámetros cinéticos, inmunofenotipo y potencial de diferenciación de las hMSC-TA obtenidas de DV en comparación con las de DF.
• Si bien se planea aumentar el número de donantes de ambas fuentes para validar los datos obtenidos. Los mismos hacen pensar que ambas fuentes serían equivalentes.
• Por otro lado, se evaluó el perfil de citoquinas liberadas por las hMSC-TA cultivadas a partir de donantes vivos quedando pendiente la evaluación en los sobrenadantes de los cultivos de hMSC-TA de donantes fallecidos.

Agradecimientos:
A CSIC por la financiación.
A la Lic. Ana Laura Suárez por su gran apoyo en el procesamiento de los bloques de parafina.
Al Laboratorio de Citometría de Flujo y Biología Molecular por permitirme el uso del equipamiento y el apoyo técnico.
Al Sector de Microbiología del Laboratorio Clínico por el análisis microbiológico.

Información de Contacto: lecharte@gmail.com